Иммуногистохимическое исследование туберкулем легких прогрессирующего течения

• Гималдинова Наталья Евгеньевна
• Любовцева Любовь Алексеевна
• Сергеев Александр Владиславович

Резюме

Микобактериями туберкулеза инфицировано около четверти населения мира. Изучение новых клеточных и молекулярных механизмов, участвующих в иммунном ответе на микобактерии, необходимо для разработки современных персонализированных протоколов лечения пациентов.

Цель исследования - изучение взаимодействий иммунокомпетентных клеток в разных зонах легких при туберкулеме прогрессирующего течения.

Материал и методы. Изучен аутопсийный материал верхних долей правого легкого (I-II сегментов), взятый у 30 мужчин в возрасте от 35 до 50 лет, прижизненно больных туберкулемой. Исследование проводили в 2 зонах: в капсуле туберкулемы и прилежащих к ней областях. Группа сравнения - 10 условно здоровых мужчин, прижизненно не болевших туберкулезом, погибших в дорожно-транспортном происшествии. Состояние клеточного иммунитета оценивали с помощью иммуногистохимического метода; использована панель моноклональных антител к CD8, CD4, CD79a и Fascin (RTU; Leica, Германия).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Statistica 10.0, Microsoft Excel 2010. Рассчитывали среднюю арифметическую и ее ошибку, коэффициент корреляции. Различия считали статистически достоверными при р≤0,05.

Результаты и обсуждение. В группе условно здоровых в ткани легкого CD4⁺- и CD8⁺-Т-лимфоциты определены преимущественно в интерстициальном пространстве, единично - около кровеносных сосудов и в собственной пластинке слизистой оболочки бронхов.

В зоне капсулы туберкулемы прогрессирующего течения выявлено преобладание CD8⁺-Т-лимфоцитов. В капсуле туберкулемы и в перифокальной зоне отмечено снижение числа CD4⁺-Т-лимфоцитов при увеличении CD8⁺-клеток. Скопление CD8⁺-Т-лимфоцитов вокруг кровеносных сосудов достигало до 20±0,3 клетки в поле зрения. Отмечено увеличение числа внутриальвеолярных и интерстициальных макрофагов, которые образовывали контакты с Т-хелперами. Значение иммунорегуляторного индекса во всех исследуемых зонах прогрессирующей туберкулемы соответствовало иммунодефициту. Отмечено увеличение числа CD8⁺, CD79а и Fascin в перифокальной зоне по сравнению с группой "условно здоровые". Вокруг туберкулемы преобладали CD79а⁺-клетки. В ходе корреляционного анализа установлено наличие разнонаправленных и разной силы корреляционных связей между изученными парами иммунокомпетентных клеток.

Заключение. С помощью иммуногистохимического метода показано, что при туберкулеме прогрессирующего течения происходит активация иммунокомпетентных клеток разных звеньев иммунного ответа.

Ключевые слова: туберкулема; CD4+-Т-лимфоциты; CD8+-Т-лимфоциты; CD79a; Fascin; иммуно­регуляторный индекс; микобактерии

Микобактериями туберкулеза инфицировано около четверти населения мира [1]. Особый интерес среди всех форм вторичного туберкулеза вызывает туберкулема, или казеома. С одной стороны, ее образование можно рассматривать как благоприятное течение заболевания, так как формирование фиброзной капсулы вокруг очага казеозного некроза ограничивает распространение микобактерий туберкулеза в легких. С другой стороны, при снижении резистентности организма казеома может стать причиной прогрессирующего течения воспаления с формированием очагов деструкции. Известны 2 варианта прогрессирования этой формы туберкулеза [2]. В первом случае появляется зона перифокального воспаления с дочерними бронхолобулярными очагами у границ казеозного некроза. Второй вариант прогрессирования связан с размягчением (расплавлением) казеоза, формированием каверны и преимущественно бронхогенной диссеминацией микобактерий туберкулеза. Соотношение слоев в капсуле туберкулемы является морфологическим ориентиром активности течения специфического процесса в туберкулемах [3]. Преобладание грануляционного слоя над волокнистым на фоне лимфоидной инфильтрации выявляют при высокой активности инфекционного процесса туберкулеза и возможности дальнейшего прогрессирования заболевания [2].

Иммунная система организма человека является ключевым звеном в предотвращении распространения микобактерий. При этом важную роль играют различные типы клеток: макрофаги, дендритные клетки, Т-лимфоциты, продуцирующие интерферон γ, а также продукция провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 (ИЛ-6), ИЛ-12 и ИЛ-23/ИЛ-17 [4]. С каскадом местных клеточных взаимодействий связано развитие тканевых реакций, которые могут привести как к активации, так и к затуханию специфического воспаления в ткани легких.

Изучение клеточных и молекулярных механизмов, участвующих в иммунном ответе на микобактерии, необходимо для разработки персонализированных протоколов лечения пациентов, в том числе направленных на предотвращение рецидива туберкулезной инфекции.

Цель работы - изучение взаимодействий иммунокомпетентных клеток в разных зонах туберкулемы легких прогрессирующего течения.

Материал и методы

Исследование проведено на базе БУ "Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы" Минздрава Чувашии. Изучали аутопсийный материал верхних долей правого легкого (I-II сегментов), взятый у 30 мужчин в возрасте от 35 до 50 лет, прижизненно больных туберкулемой. Формирование выборки осуществляли на основе изучения сопроводительной медицинской документации. Учитывали локализацию туберкулемы, степень выраженности и активности туберкулезного процесса, заключения рентгенологических исследований органов грудной клетки и результаты бактериологического исследования мокроты.

Исследование проводили в двух зонах: в капсуле туберкулемы и перифокальной области, обозначенной как "вне капсулы". Группа сравнения - 10 условно здоровых мужчин, погибших в дорожно-транспортном происшествии (ДТП), прижизненно не болевших туберкулезом, у которых были взяты для сравнения ткани верхних долей правого легкого (I-II сегментов). Результаты иммуногистохимического (ИГХ) исследования в группе сравнения сопоставляли с данными исследования участков ткани легкого "вне капсулы" больных туберкулемой.

Исследование проведено согласно нормативно-правовым документам (Федеральный закон № 323‑ФЗ от 21.11.2011 "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации") и одобрено этическим комитетом медицинского факультета ФГБОУ ВО "Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова" (протокол № 3/4 от 31.01.2017).

Гистохимическое исследование проведено в двух зонах срезов ткани верхних долей правого легкого: в капсуле туберкулемы и в прилежащих к ней областях. Морфологические изменения в ткани легких и дифференцировку участков, пораженных и не пораженных микобактериями туберкулеза, оценивали при окраске препаратов гематоксилином и эозином.

ИГХ-метод с использованием моноклональных антител к CD8, CD4, CD79a и Fascin в готовом разведении (RTU; Leica, Германия) применяли для выявления числа основных иммунокомпетентных клеток, отвечающих за клеточное и гуморальное звено иммунитета, и их взаимодействий. Ядра клеток докрашивали железным гематоксилином. Число иммунокомпетентных клеток подсчитывали с использованием светового микроскопа Сarl Zeiss Primo Star в 10 полях зрения при 400-кратном увеличении.

Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) вычисляли как отношение CD4⁺/CD8⁺ и оценивали следующим образом: значения 1,5-2,1 соответствовали нормальному иммунному ответу, более 2,2 - избыточному иммунному ответу, менее 1,0 - иммунодефициту [5, 6].

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Statistica 10.0, Microsoft Excel 2010. Рассчитывали следующие показатели: М_ср - средняя арифметическая величина; m - ошибка средней арифметической величины. Статистическую достоверность определяли по критерию Манна-Уитни (t). Корреляционный анализ для определения клеточных взаимодействий в каждой исследуемой зоне туберкулемы и в легких группы "условно здоровые" применяли для следующих пар: CD4⁺/CD8⁺, CD4⁺/CD79а, CD4⁺/Fascin, CD8⁺/CD4⁺, CD8⁺/CD79а, CD8⁺/Fascin, CD79а/CD4⁺, CD79а/CD8⁺, CD79а/Fascin, Fascin/CD4⁺, Fascin/CD8⁺, Fascin/CD79а. Значение коэффициента корреляции меньше 0,5 - связь в паре слабая или отсутствует; 0,5-0,7 - связь умеренная; больше 0,7 - связь в паре сильная. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

ИГХ-исследование препаратов ткани легкого с использованием моноклональных антител в группе "условно здоровые" позволило определить, что CD4⁺- и CD8⁺-клетки были локализованы преимущественно в интерстициальном пространстве, единично - около кровеносных сосудов и в собственной пластинке слизистой оболочки бронхов. Число CD4⁺-клеток преобладало над количеством CD8⁺ (табл. 1). Клетки CD79а⁺ и Fascin⁺ в единичном числе обнаружены в интерстициальном пространстве. Индекс соотношения CD4⁺/CD8⁺ (ИРИ) составил 1,6, что соответствует нормальному иммунному ответу.

При исследовании аутопсийного материала из группы больных с прогрессирующей туберкулемой, вокруг зоны казеозного некроза выявлена соединительнотканная капсула, окруженная перифокальным воспалением в виде серозного экссудата в альвеолах и очагов отсева, представленных клеточными инфильтратами (рис. 1). В капсуле туберкулемы имелись скопления лимфоцитов, напоминающих лимфоидные узелки.

В зоне капсулы туберкулемы прогрессирующего течения среди всех иммунокомпетентных клеток выявлено преобладание CD8⁺-Т-лимфоцитов над CD4⁺ в 2 раза, а по сравнению с CD79а и Fascin - в 4,1 и 15 раз соответственно (см. табл. 1, рис. 2А).

В участках перифокального воспаления выявлено значительно меньшее по сравнению с капсулой туберкулемы число иммунных клеток, за исключением дендритных клеток (Fascin), которые в основном локализовались в интерстициальном пространстве (см. табл. 1). Количество CD4⁺-Т-лимфоцитов было снижено в 2,9 раза, а CD8⁺ и CD79а - в 4,7 и 1,1 раза соответственно (см. рис. 2Б). Следует отметить, что вне капсулы, в отличие от капсулы туберкулемы, преобладали CD79а⁺-лимфоциты. Число всех иммунокомпетентных клеток в данной зоне по сравнению с группой "условно здоровые" было повышенным, за исключением Т-хелперов. Выявлено увеличение числа внутри альвеолярных и интерстициальных макрофагов, которые местами образовывали контакты с CD4⁺-Т-лимфоцитами (рис. 3). Также появлялись групповые скопление CD8⁺-клеток вокруг кровеносных сосудов до 20±0,3 в поле зрения.

Значение ИРИ во всех исследуемых зонах прогрессирующей туберкулемы было сниженным, что соответствовало иммунодефициту.

При изучении корреляционных сопряжений в парах между иммунными клетками в группе "условно здоровые" выявлена умеренная положительная связь в паре CD8⁺/CD4⁺ и Fascin/CD79а, а также умеренные отрицательные связи между CD4⁺/CD8⁺ и CD79а/ Fascin.

В соединительнотканной капсуле прогрессирующей туберкулемы определены умеренные положительные связи в паре CD4⁺/CD8⁺ и CD79а/CD4⁺ (табл. 2). В зоне перифокального воспаления отмечено появление сильных положительных корреляционных связей в трех парах: CD4⁺/CD8⁺, CD4+/CD79а и CD8+/CD79а (см. табл. 2).

В ходе корреляционного анализа установлено наличие разнонаправленных и разной силы корреляционных связей между изученными парами иммунокомпетентных клеток.

Заключение

Изучение клеточного местного иммунитета при воспалительных процессах в органах дыхания является актуальной проблемой современной персонализированной медицины. Известно, что при поражении легких микобактерией tuberculosis происходит активация клеток врожденного и адаптивного иммунного ответа [7]. К клеткам врожденного иммунитета в легких отнесены альвеолярные макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы. Антимикобактериальный ответ при туберкулезе связан с CD4⁺- и CD8⁺-Т-клетками, которые являются клетками адаптивного иммунного ответа. Известно, что возбудитель туберкулеза способен длительно персистировать в организме человека за счет способности уклоняться от иммунных реакций и подавлять их.

В проведенном исследовании выявлены статистически значимые различия как в составе иммунокомпетентных клеток при туберкулеме прогрессирующего течения, так и в их межклеточных взаимодействиях. Преобладающими клетками в капсуле туберкулемы были CD8⁺-Т-лимфоциты. Известно, что эти клетки могут оказывать прямое цитотоксическое действие на микобактерии, способны разрушать инфицированные макрофаги путем синтеза перфорина, а также, выделяя гранулизин, уничтожать внутриклеточно расположенных возбудителей [8]. Кроме того, в капсуле гранулемы увеличивается число В-лимфоцитов по сравнению с перифокальной зоной, что, возможно, приводит к появлению дополнительного взаимодействия их с CD4⁺-Т-лимфоцитами.

Из данных литературы известно, что такое взаимодействие может быть направлено на контроль антиген-специфического В-клеточного иммунитета [9]. Развитие длительного гуморального иммунитета, характеризующегося формированием высокоаффинных, преимущественно IgG1-антител, является необходимым компонентом формирования защитного иммунитета против патогенов [9]. В зоне перифокального воспаления обнаружено увеличение количества иммунных клеток, за исключением Т-хелперов. Преобладание числа цитотоксичных лимфоцитов в этой зоне с преимущественной локализацией вокруг кровеносных сосудов, с одной стороны, возможно, направлено на ограничение распространения микобактерий по кровеносным и лимфатическом сосудам, а с другой - может быть связано с их миграцией из других лимфоидных органов. Выявление корреляционных связей разной силы между популяциями Т- и В-лимфоцитов, вероятно, отражает активацию резервных защитных звеньев как клеточного, так и гуморального иммунитета. Более того, при данной патологии возникает один из видов редких взаимодействий Т-киллеров с В-лимфоцитами.

Имеются научные публикации о классическом взаимодействии разных видов лимфоцитов и макрофагов [10-12]. Известно, что связывание чужеродных молекул с антиген-распознающими рецепторами служит источником внутриклеточных сигналов, приводящих к дифференцировке эффекторных клеток адаптивного иммунитета. При этом происходит передача сигналов, отвечающих за экспрессию генов и воспалительную реакцию. Кроме того, Т-лимфоциты, несущие корецептор CD8, способны считывать мембранные "стрессорные" молекулы инфицированных клеток и разрушать клетки-мишени путем контактного киллинга [13-15]. Возможно, обнаружение корреляционной связи между популяциями Т- и В-лимфоцитов отражает проявление описанного механизма.

В прогрессирующей туберкулеме увеличение числа альвеолярных и интерстициальных макрофагов, вероятно, связано со стимуляцией фагоцитоза и, как следствие, с активацией врожденного иммунитета. Повышение числа дендритных клеток как в капсуле, так и в перифокальной зоне, очевидно, направлено на усиление дифференцировки и созревания лимфоцитов.

Таким образом, при прогрессирующей туберкулеме легких наблюдается активация как врожденного, так и адаптивного иммунитета.

Литература

1. Сюнякова Д.А. Особенности эпидемиологии туберкулеза в мире и в России в период 2015-2020 гг. Аналитический обзор // Социальные аспекты здоровья населения. 2021. Т. 67, № 3. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/osobennosti-epidemiologii-tuberkuleza-v-mire-i-v-rossii-v-period-2015-2020-gg-analiticheskiy-obzor

2. Холодок О.А., Григоренко А.А., Черемкин М.И. Туберкулема легкого как форма туберкулезного процесса // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2014. Вып. 53. С. 126-131. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/tuberkulema-legkogo-kak-forma-tuberkuleznogo-protsessa

3. Холодок О.А., Григоренко А.А., Черемкин М.И. Клиническое наблюдение течения туберкулем легкого с морфологической интерпретацией их активности // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2014. Вып. 51. С. 137-140.

4. Matucci A., Maggi E., Vultaggio A. Cellular and humoral immune responses during tuberculosis infection: useful knowledge in the era of biological agents // J. Rheumatol. Suppl. 2014. Vol. 91. P. 17-23. DOI: https://doi.org/10.3899/jrheum.140098 PMID: 24788996.

5. Елипашев А.А., Никольский В.О., Шпрыков А.С. Зависимость активности туберкулезного воспаления (по морфологическим данным) от различной давности заболевания у пациентов с ограниченным лекарственно устойчивым туберкулезом легких // Вестник новых медицинских технологий. Электронное издание. 2016. № 1. С. 54-59.

6. Корженевский А.А. Интерпретация иммунограммы при воспалительных процессах: учебное пособие. Уфа : Изд-во ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, 2017. 115 с.

7. Anes E., Pires D., Mandal M., Azevedo-Pereira J.M. ESAT-6 a major virulence factor of Mycobacterium tuberculosis // Biomolecules. 2023. Vol. 13, N 6. P. 968. DOI: https://doi.org/10.3390/biom13060968 PMID: 37371548; PMCID: PMC10296275.

8. Макаров И.Ю., Барабаш Р.А. Морфологическая характеристика клеточно-тканевых реакций при туберкулезной инфекции, вызванной лекарственно-устойчивыми штаммами // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2018. Вып. 67. С. 93-101. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/morfologicheskaya-harakteristika-kletochno-tkanevyh-reaktsiy-pri-tuberkuleznoy-infektsii-vyzvannoy-lekarstvenno-ustoychivymi

9. Топтыгина А.П. Общие закономерности формирования и поддержания специфического гуморального иммунного ответа на примере ответа на вирусы кори и краснухи // Инфекция и иммунитет. 2014. Т. 4, № 1. С. 7-14. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/obschie-zakonomernosti-formirovaniya-i-podderzhaniya-spetsificheskogo-gumoralnogo-immunnogo-otveta-na-primere-otveta-na-virusy-kori-i

10. Ярец Ю.И. Интерпретация результатов иммунограммы. Гомель : ГУ "РНПЦ РМиЭЧ", 2020. 38 с.

11. Никонова А.А., Хаитов М.Р., Хаитов Р.М. Характеристика и роль различных популяций макрофагов в патогенезе острых и хронических заболеваний легких // Медицинская иммунология. 2017. Т. 19, № 6. С. 657-672. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/harakteristika-i-rol-razlichnyh-populyatsiy-makrofagov-v-patogeneze-ostryh-i-hronicheskih-zabolevaniy-legkih

12. Магомедова З.С., Каграманова З.С. Литературный обзор: современные представления о функциональных особенностях иммунной системы // Научное обозрение. Медицинские науки. 2016. № 2. С. 68-80. URL: https://science-medicine.ru/ru/article/view?id=851

13. Черешнева М.В., Черешнев В.А. Иммунологические механизмы локального воспаления // Медицинская иммунология. 2011. Т. 13, № 6. С. 557-568. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/immunologicheskie-mehanizmy-lokalnogo-vospaleniya

14. Steinert E.M., Schenkel J.M., Fraser K.A. et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance // Cell. 2015. Vol. 161. P. 737-749. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.03.031

15. Marchesini Tovar G., Gallen C., Bergsbaken T. CD8+ tissue-resident memory T cells: versatile guardians of the tissue // J. Immunol. 2024. Vol. 212, N 3. P. 361-368. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.2300399 PMID: 38227907; PMCID: PMC10794029.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)